Détail

Un essai Eawag sur des cellules de poissons remplace les expérimentations animales

24 juin 2021 | Annette Ryser

L’OCDE donne son feu vert pour l’essai sur une lignée cellulaire de poissons développé à l’Eawag. La voie est ainsi libre pour les entreprises et les autorités du monde entier qui pourront déterminer la toxicité chimique de l’environnement sans avoir recours à des expérimentations animales.

Une multitude de produits chimiques sont utilisés dans les produits du quotidien, dans l’agriculture et dans l’industrie. Nombre d’entre eux finissent tôt ou tard par se retrouver dans l’environnement. Afin que ces substances soient homologuées sur le marché, les fabricants doivent d’abord prouver qu’elles sont inoffensives pour l’homme et la nature. C’est le rôle des essais de toxicité pour lesquels des êtres vivants sont exposés aux effets des produits chimiques. Chaque année, des milliers de poissons meurent parce qu’ils servent de cobayes pour déterminer les effets de ces produits sur les vertébrés aquatiques.

Grâce à un procédé développé ces dernières années par l’Institut de recherche de l’eau Eawag, ces méthodes appartiendront toutefois bientôt au passé. Cet essai basé sur des cellules branchiales isolées des truites arc-en-ciel a été publié par l’Organisation de Coopération et de Développement Économique (OCDE) en tant que ligne directrice la plus récente dans le domaine de la toxicologie environnementale. La voie est ainsi tracée pour une procédure d’agrément sans expérimentation animale.
 

Branchies saines colorées d’une truite arc-en-ciel: noyau cellulaire (bleu), membranes (vert), mitochondries (rouge), lysosomes (rose).
(Photo: Vivian Lu Tan, Eawag)

Les entreprises vivement intéressées

L’essai portant sur lignée cellulaire de poissons représente la première alternative mondiale aux expérimentations sur des poissons vivants. La nouvelle ligne directrice de l’OCDE permet aux entreprises de recourir à l’essai sur lignée cellulaire de poissons pour développer leurs produits et de joindre les résultats aux dossiers de demande d’agrément des produits chimiques. «L’industrie s’intéresse vivement aux essais déconnectés de toute expérimentation animale», confirme la prof. Kristin Schirmer, cheffe de département à l’Eawag, qui a dirigé ces travaux pionniers avec Melanie Fischer (Eawag). Les exigences pesant sur l’évaluation des risques environnementaux sont d’une part de plus en plus strictes et le nombre de nouveaux produits chimiques qui doivent être testés augmente d’autre part constamment. L’essai sur lignée cellulaire de poissons ménage par ailleurs les ressources. La miniaturisation résultant de l’emploi de cellules permet en effet d’économiser des produits chimiques et de l’eau, mais aussi de gagner du temps.

«L’industrie s’intéresse vivement aux essais déconnectés de toute expérimentation animale.»
Kristin Schirmer

Kristin Schirmer s’attend à ce que les autorités règlementaires telles que l’AEPC à Helsinki ou l’EPA aux États-Unis acceptent de plus en plus l’essai sur lignée cellulaire de poissons comme substitut équivalent à l’essai ordinaire sur les poissons: «En ce qui nous concerne, la recommandation de l’OCDE a été la dernière étape importante après la certification ISO de notre méthode il y a deux ans, ce qui signifie que plus rien ne s’oppose à une procédure d’agrément sans expérimentation animale».

Eawag contribue ainsi au développement de la toxicologie en réduisant le nombre d’expérimentations animales. Des essais d’écotoxicité ont en effet été menés sur près de 8000 poissons en Suisse en 2019.

L’essai sur lignée cellulaire de poissons – brièvement expliqué

[Translate to Français:]

L’idée d’origine

Cette approche signale la fin d’une longue et intensive période qui a exigé ténacité et soutien de la part du milieu professionnel. Le professeur Schirmer a développé cette idée pendant sa thèse de doctorat au milieu des années 90. Elle travaillait à l’époque à la University of Waterloo (Canada) sur exactement la lignée cellulaire sur laquelle repose la méthode aujourd’hui. La lignée cellulaire de Kristin Schirmer remonte à son directeur de thèse, Niels C. Bols, qui fut le premier à isoler les cellules branchiales de la truite arc-en-ciel et à les cultiver afin qu’elles puissent se reproduire à l’infini.

«Nous avons choisi les cellules branchiales car ce sont les branchies qui entrent d’abord en contact avec un produit chimique du fait de leur surface importante chez le poisson» explique Kristin Schirmer. Si les produits chimiques endommagent les cellules branchiales, certaines fonctions vitales pour le poisson telle que son alimentation en oxygène ne fonctionnent plus. «Par conséquent, en observant les effets d’un produit chimique sur les cellules branchiales, nous sommes en mesure de prévoir l’impact de ce produit sur un poisson vivant», précise Kristin Schirmer.
 

Les cellules utilisées pour l’essai proviennent de la truite arc-en-ciel.
(Photo: Andreas Hartl)

L’épreuve de vérité

La subvention attribuée à Kristin Schirmer en 2006 par le Conseil européen de l’industrie chimique (CEFIC) pour une proposition de projet a lancé le développement de l’essai sur lignée cellulaire de poissons à présent validé. Kristin Schirmer a d’abord poursuivi ses recherches en tant que cheffe de département au Centre Helmholtz pour la recherche environnementale de Leipzig puis, dès 2008, en qualité de cheffe de département à l’Eawag. En 2009, Melanie Fischer, ingénieure et laborantine, a rejoint l’équipe.

«Lors de la première phase, nous avons développé et optimisé notre méthode avant de comparer les résultats avec les essais ordinaires menés sur des poissons», explique Kristin Schirmer. Une étude publiée en 2013 a ainsi prouvé pour la première fois que le nouvel essai sur lignée cellulaire de poissons conduisait aux mêmes valeurs de toxicité pour plus de 30 produits chimiques que l’essai sur les poissons. «Il a ensuite fallu démontrer que la méthode fonctionnait aussi dans d’autres laboratoires», explique Kristin Schirmer. Six laboratoires d’entreprises industrielles et d’universités participé à l’étude circulaire internationale réalisée à cette fin en 2013-2014. Les résultats qu’ils ont obtenu avec la méthode Eawag étaient reproductibles et comparables.
 

Melanie Fischer (à g.) et la prof. Kristin Schirmer.
(Photo: Conseil des EPF)

Objectif atteint

Les données de cette étude ont jeté les bases de la certification ISO 2019 et de la ligne directrice OCDE 2021. «La certification accordée par des organisations au rayonnement international est très importante. Elle constitue en effet la seule méthode permettant de garantir que les essais seront réalisés de manière standardisée dans le monde entier pour que les résultats soient reconnus», déclare Kristin Schirmer. Il n’a fallu que deux ans de la soumission à l’OCDE à la validation qui vient d’avoir lieu. Au cours de cette période exceptionnelle courte, la méthode a été révisée à nouveau dans le cadre d’un processus élaboré afin d’harmoniser les propositions et les opinions d’experts de nombreux pays représentatifs et d’organisations. L’équipe a été assistée par les représentants de la Suisse (Petra Kunz, Office fédéral de l’environnement OFEV) et de la Norvège (Sjur Andersen, office fédéral de l’environnement norvégien et Adam Lillicrap, NIVA). Eszter Simon (OFEV) a soutenu le travail en tant qu'expert.

«L’adoption rapide de cette première méthode in vitro portant sur des essais d’écotoxicité traduit l’engagement des pays de l’OCDE en faveur de la réduction des expérimentations animales.»
Leon van der Wal, OCDE

Kristin Schirmer estime que la ligne directrice a été adoptée si rapidement grâce à l’intérêt et au soutien indéfectible de toutes les parties prenantes: «Nous avons discuté activement avec les pays de l’OCDE, les industriels, les ONG et les autorités règlementaires.» Leon van der Wal, de l’OCDE, le confirme également: «L’adoption rapide de cette première méthode in vitro portant sur des essais d’écotoxicité traduit l’engagement des pays de l’OCDE en faveur de la réduction des expérimentations animales. Nous le devons également à la communication organisée et transparente des pays qui ont joué un rôle de premier plan ainsi qu’au travail acharné des concepteurs de la méthode et des experts de l’OCDE qui l’ont examinée.»

Kristin Schirmer constate rétrospectivement que: «Notre courbe d’apprentissage a été très abrupte. Mais tout le temps et l’énergie investis ont porté leurs fruits: le succès de ces méthodes d’évaluations alternatives de l’écotoxicité sans expérimentation animale est formidable et durable.»
 

Développement d’un essai sur lignée cellulaire de poissons afin de déterminer une toxicité aiguë pour les poissons.
(Photo: aQuaTox-Solutions)

Une recherche primée
Le travail de l’Eawag visant à développer des méthodes d’essai dépourvues d’expérimentations animales est d’une importance capitale. Tel est également l’avis du Centre de compétence suisse 3R (3RCC). L’association souhaite remplacer, réduire et améliorer les expérimentations animales. En 2019, elle a décerné le 3Rs Award à la chercheuse, et à sa collègue Melanie Fischer, pour leurs travaux de recherche. Le 3RCC a par ailleurs attribué une bourse de 250’000 francs aux scientifiques en 2019. Ces fonds leur permettent de travailler sur le développement d’un milieu sans sérum capable de remplacer le sérum fœtal de veaux qui reste indispensable pour cultiver des cellules.

aQuaTox-Solutions
Compte tenu de l’intérêt croissant que des entreprises, des exploitants de stations d’épuration et des offices de l’environnement manifestent à l’essai en vue d’y recourir eux-mêmes en tant que service, l’Eawag a fondé aQuaTox-Solutions en 2017. aQuaTox-Solutions est le premier prestataire au monde qui propose ce procédé d’essai ainsi que d’autres basés sur des lignées cellulaires de poissons. Du fait de la certification de l’OCDE et la confirmation de sa grande robustesse, de sa transférabilité et de sa comparabilité, cette procédure d’essai devrait continuer à susciter un vif intérêt. 

Photo de couverture: Eawag

Publications originales

Extbase Variable Dump
array(2 items)
   publications => '18765,7210' (10 chars)
   libraryUrl => '' (0 chars)
Extbase Variable Dump
array(2 items)
   0 => Snowflake\Publications\Domain\Model\Publicationprototypepersistent entity (uid=18765, pid=124)
      originalId => protected18765 (integer)
      authors => protected'Fischer, M.; Belanger, S. E.; Berckmans, P.; Bernhard,&n
         bsp;M. J.; Bláha, L.; Coman Schmid, D. E.; Dyer, S
         . D.; Haupt, T.; Hermens, J. L. M.; Hultman, M
         . T.; Laue, H.; Lillicrap, A.; Mlnaříková, M.; Natsch
         , A.; Novák, J.; Sinnige, T. L.; Tollefsen, K.&nbs
         p;E.; von Niederhäusern, V.; Witters, H.; Županič, A.; Sch
         irmer, K.
' (470 chars) title => protected'Repeatability and reproducibility of the RTgill-W1 cell line assay for predi
         cting fish acute toxicity
' (101 chars) journal => protected'Toxicological Sciences' (22 chars) year => protected2019 (integer) volume => protected169 (integer) issue => protected'2' (1 chars) startpage => protected'353' (3 chars) otherpage => protected'364' (3 chars) categories => protected'in vitro alternatives; round-robin study; validation' (52 chars) description => protected'Predicting fish acute toxicity of chemicals <i>in vitro</i> is an attractive
          alternative method to the conventional approach using juvenile and adult fi
         sh. The rainbow trout (<i>Oncorhynchus mykiss</i>) cell line assay with RTgi
         ll-W1 cells has been designed for this purpose. It quantifies cell viability
          using fluorescent measurements for metabolic activity, cell- and lysosomal-
         membrane integrity on the same set of cells. Results from over 70 organic ch
         emicals attest to the high predictive capacity of this test. We here report
         on the repeatability (intralaboratory variability) and reproducibility (inte
         rlaboratory variability) of the RTgill-W1 cell line assay in a round-robin s
         tudy focusing on 6 test chemicals involving 6 laboratories from the industri
         al and academic sector. All participating laboratories were able to establis
         h the assay according to preset quality criteria even though, apart from the
          lead laboratory, none had previously worked with the RTgill-W1 cell line. C
         oncentration-response modeling, based on either nominal or geometric mean-de
         rived measured concentrations, yielded effect concentrations (EC50) that spa
         nned approximately 4 orders of magnitude over the chemical range, covering a
         ll fish acute toxicity categories. Coefficients of variation for intralabora
         tory and interlaboratory variability for the average of the 3 fluorescent ce
         ll viability measurements were 15.5% and 30.8%, respectively, which is compa
         rable to other fish-derived, small-scale bioassays. This study therefore und
         erlines the robustness of the RTgill-W1 cell line assay and its accurate per
         formance when carried out by operators in different laboratory settings.
' (1668 chars) serialnumber => protected'1096-6080' (9 chars) doi => protected'10.1093/toxsci/kfz057' (21 chars) uid => protected18765 (integer) _localizedUid => protected18765 (integer)modified _languageUid => protectedNULL _versionedUid => protected18765 (integer)modified pid => protected124 (integer)
1 => Snowflake\Publications\Domain\Model\Publicationprototypepersistent entity (uid=7210, pid=124) originalId => protected7210 (integer) authors => protected'Tanneberger,&nbsp;K.; Knöbel,&nbsp;M.; Busser,&nbsp;F.&nbsp;J.&nbsp;M.; Sin
         nige,&nbsp;T.&nbsp;L.; Hermens,&nbsp;J.&nbsp;L.&nbsp;M.; Schirmer,&nbsp;K.
' (150 chars) title => protected'Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity as
         say
' (79 chars) journal => protected'Environmental Science and Technology' (36 chars) year => protected2013 (integer) volume => protected47 (integer) issue => protected'2' (1 chars) startpage => protected'1110' (4 chars) otherpage => protected'1119' (4 chars) categories => protected'' (0 chars) description => protected'The OECD test guideline 203 for determination of fish acute toxicity require
         s substantial numbers of fish and uses death as an apical end point. One pot
         ential alternative are fish cell lines; however, several studies indicated t
         hat these appear up to several orders of magnitude less sensitive than fish.
          We developed a fish gill cell line-based (RTgill-W1) assay, using several m
         easures to improve sensitivity. The optimized assay was applied to determine
          the toxicity of 35 organic chemicals, having a wide range of toxicity to fi
         sh, mode of action and physicochemical properties. We found a very good agre
         ement between in vivo and in vitro effective concentrations. For up to 73% o
         f the tested compounds, the difference between the two approaches was less t
         han 5-fold, covering baseline toxicants but as well compounds with presumed
         specific modes of action, including reactivity, inhibition of acetylcholine
         esterase or uncoupling of oxidative phosphorylation. Accounting for measured
          chemical concentrations eliminated two outliers, the hydrophobic 4-decylani
         line and the volatile 2,3-dimethyl-1,3-butadiene, with an outlier being oper
         ationally defined as a substance showing a more than 10-fold difference betw
         een in vivo/in vitro effect concentrations. Few outliers remained. The most
         striking were allyl alcohol (2700-fold), which likely needs to be metabolica
         lly activated, and permethrin (190-fold) and lindane (63-fold), compounds ac
         ting, respectively, on sodium and chloride channels in the brain of fish. We
          discuss further developments of this assay and suggest its use beyond predi
         cting acute toxicity to fish, for example, as part of adverse outcome pathwa
         ys to replace, reduce, or refine chronic fish tests.
' (1724 chars) serialnumber => protected'0013-936X' (9 chars) doi => protected'10.1021/es303505z' (17 chars) uid => protected7210 (integer) _localizedUid => protected7210 (integer)modified _languageUid => protectedNULL _versionedUid => protected7210 (integer)modified pid => protected124 (integer)
Fischer, M.; Belanger, S. E.; Berckmans, P.; Bernhard, M. J.; Bláha, L.; Coman Schmid, D. E.; Dyer, S. D.; Haupt, T.; Hermens, J. L. M.; Hultman, M. T.; Laue, H.; Lillicrap, A.; Mlnaříková, M.; Natsch, A.; Novák, J.; Sinnige, T. L.; Tollefsen, K. E.; von Niederhäusern, V.; Witters, H.; Županič, A.; Schirmer, K. (2019) Repeatability and reproducibility of the RTgill-W1 cell line assay for predicting fish acute toxicity, Toxicological Sciences, 169(2), 353-364, doi:10.1093/toxsci/kfz057, Institutional Repository
Tanneberger, K.; Knöbel, M.; Busser, F. J. M.; Sinnige, T. L.; Hermens, J. L. M.; Schirmer, K. (2013) Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay, Environmental Science and Technology, 47(2), 1110-1119, doi:10.1021/es303505z, Institutional Repository