Alors que CRISPR/Cas9 a déjà largement été utilisé pour les mammifères afin de fabriquer des cellules génétiquement modifiées, il n’existait rien de comparable pour les poissons. Marina Zoppo, qui a présenté sa thèse en 2018 à l’Université de Pise, est arrivée avec une mission claire pour le département de Toxicologie environnementale de l’Eawag: établir la méthode pour les cellules de poissons, en particulier les cellules de la truite arc-en-ciel.

La chercheuse arrivait à l’Eawag avec une bonne expérience de la méthode. Mais elle se souvient: «J’étais un peu surprise de la résistance étonnante des cellules de poissons aux manipulations. Je n’y avais jamais été confrontée avec d’autres types de cellules». Mais la raison est pourtant évidente, explique la biologiste: en tant que poissons d’eau froide, les truites arc-en-ciel possèdent une membrane cellulaire d’une autre composition que celle des mammifères. Leur membrane cellulaire est pour cela beaucoup plus rigide. Marina Zoppo a relevé le défi, expérimenté avec des impulsions et tensions électriques jusqu’à trouver la juste combinaison des deux qui rend la membrane cellulaire perméable aux molécules ARN et aux protéines (cette méthode s’appelle l’électroporation). Le succès fut au rendez-vous et la chercheuse a finalement réussi à introduire dans la cellule l’ARN guide en même temps que la protéine Cas9 nécessaire aux ciseaux génétiques. Mais elle fut immédiatement confrontée au problème suivant.
 

Les ciseaux avaient donc pris possession des cellules avec succès et déployé leur magie: ils avaient trouvé très exactement le gène choisi par Mme Zoppo dans le génome de la truite arc-en-ciel, où ils avaient modifié la séquence d'ADN et provoqué dans le gène ce qu’on nomme une Knock-out-Mutation. Cela signifie qu’à cause de la mutation dans la séquence d'ADN, le gène ne pouvait plus jouer son rôle attitré dans la cellule: un excellent système d’expérimentation pour la chercheuse afin d’étudier préciseément ce rôle du gène. «Nous observons ce qui se passe lorsqu'un rouage du système fait défaut. De cette manière, les fonctions des gènes jusqu’alors mal connues peuvent être élucidées», explique Mme Zoppo.

Mais il y avait un petit problème: Le système CRISPR/Cas9 a certes la capacité de faire muter un gène choisi de manière ciblée, mais: L’exacte séquence d'ADN alors créée se forme de façon aléatoire dans chaque cellule. «Et parce que nous avions utilisé plusieurs cellules pour l’expérience, chacune d’elles avait à présent sa propre séquence d’ADN», explique Mme Zoppo. À présent, la tâche de la chercheuse était de prélever une «cellule mère» et de la multiplier afin de créer une lignée cellulaire de filles clones génétiquement identiques. «Ici, cependant, les cellules de poissons se sont révélées être étonnamment originales», raconte Mme Zoppo. «Il n’était possible d’utiliser aucune des méthodes largement employées d’ordinaire que je connaissais et avais expérimentées. Cela ne fonctionnait tout simplement pas», dit Mme Zoppo.

La percée est venue d'une méthode plus ancienne utilisant de simples cylindres de clonage. Lorsque des cellules se multiplient en culture, elles forment des colonies autour de la cellule mère précurseur, lesquelles peuvent être isolées avec le cylindre et transférées sur une autre plaque. «En fait, c’est très simple une fois qu’on y a pensé», dit Mme Zoppo.

Des cellules génétiquement modifiées ont été ensemencées à faible densité dans une boîte de laboratoire à six encoches. Des colonies de cellules génétiquement identiques se sont formées. Elles ont été isolées à l'aide d'un cylindre de clonage et transférées dans un vaisseau plus grand. Figure créée à l'aide de biorender.com.
(Graphique: Eawag, Marina Zoppo)
 

Photo de couverture: Eawag / Marina Zoppo